Journal of Medical Genetics杂志在线发表了一篇关于家族性皮质肌阵挛性震颤伴癫痫（FCMTE）致病基因鉴定的研究文章，在业界引起了广泛反响。
据悉，该研究是由中南大学湘雅医院神经内科唐北沙教授团队和美国费城儿童医院王凯教授通过设计计算测序方法，与北京希望组生物科技有限公司（以下简称“希望组”）梁帆团队合作，主题为《Long-read sequencing identified intronic repeat expansions in SAMD12 from Chinese pedigrees affected with Familial Cortical Myoclonic Tremor with Epilepsy》，将神经遗传病基因克隆研究工作迈向一个新台阶。
本网记者采访了该研究项目负责人唐北沙教授及其学生曾胜博士，深入了解该项目研究的“台前幕后”，以下为访谈实录：
Q：FCMTE是一种什么疾病？
A：家族性皮质肌阵挛性震颤伴癫痫（FCMTE）是一种较为罕见的常染色体显性遗传的特发性癫痫综合征，以成年期起病的皮质肌阵挛性震颤与频率稀发的癫痫为主要临床表现。该病尚缺乏系统流行病学研究，日本学者报道其患病率为1/35000，为相对高发区，中国本土仅约20个FCMTE家系报道，但报道较少也可能是对疾病认识不够造成的。
Q：该疾病的致病机制是什么？
A：最近，FCMTE致病基因率先被日本学者克隆，致病突变为SAMD12基因内含子区“TTTCA/TTTTA”五核苷酸重复序列高度异常扩展。正常人的SAMD12基因内含子区含有约3至12个TTTTA重复，但每一种重复都有一定的正常范围。而FCMTE患者的TTTTA重复可达成百上千次，且一部分变成了TTTCA重复，大大超过了正常范围，这样的”TTTCA/TTTTA”五核苷酸重复结构被证实是致病的。
Q：阐明FCMTE的致病机制有什么科学意义？
A：在当前精准医疗发展的背景下，精准诊断是精准治疗的前提，而基因诊断是明确遗传疾病诊断的金标准，因此基因诊断对疾病的鉴别和后期治疗具有十分重要的指导意义。比如FCMTE，其是一种遗传性癫痫综合征，但又具有神经退行性疾病的某些特点，而皮质肌阵挛性震颤和原发性震颤表现很像，但两者具有完全不同的发病机理和治疗方法，明确基因诊断就能在根本上对疾病鉴别并选择最佳的治疗方案。
我们的研究首次通过长读长测序技术（LRS）鉴定出中国人群SAMD12基因内含子区短串联重复序列异常扩展导致FCMTE，不仅有助于更深入地了解癫痫疾病的分子致病机制，为中国FCMTE患者开发有效的治疗措施奠定重要的基础。同时，这项研究也有助于加速非编码区短串联重复扩展导致的其他孟德尔疾病的研究。此外，该研究还表明，以“长读长测序”为特点的三代测序技术是遗传性疾病分子诊断的有效工具，有助于推动人类基因组学的研究。
Q：为何要从FCMTE开始做三代测序研究，而不是从帕金森、渐冻症等患病人群更多且依然没找到致病基因的“大病”入手？
A：帕金森病、渐冻症等大病理论上也是可以用三代测序技术来鉴定遗传学病因的。但是这些疾病病因复杂，遗传可能只发挥了一部分作用，如果贸然用三代测序技术鉴定，后期分析会有很大的困难和障碍。而FCMTE是一个单基因遗传病，有明确的遗传模式，在致病基因克隆方面是一个很好的研究病种，且前期运用的一代、二代测序未能获得明确结果，三代测序技术互补了二代测序技术的缺陷，是可能解决因技术原因而导致致病突变漏检的。因此，运用三代测序技术是该病研究历史的发展必然。
Q：项目团队在相关研究领域具备哪些优势？
A：唐北沙教授团队一直致力于神经退行性疾病与神经遗传病致病基因克隆研究工作，早在上世纪九十年代，唐北沙教授便作为主要骨干参与了夏家辉院士团队在中国本土上克隆的第一个致病基因—“人类神经性高频性耳聋致病基因-GJB3基因”的研究工作。随后，唐北沙教授团队采用新一代测序技术相继成功鉴定克隆了SCA35致病基因TGM6、ARCA致病基因CHIP和UBA5、CMT致病基因HSP22及PKD致病基因PRRT2等，系统建立了神经系统遗传病高通量测序技术基因诊断与分析平台。
此外，希望组研究团队具备Nanopore、PacBio及BioNano等长读长技术平台，基于超算集群开发了脊髓小脑性共济失调、面肩肱型肌营养不良症等遗传病精准检测方案，不仅可以准确检测外显子区域及非编码区的致病结构变异（Structural Variation，包括CNV，串联重复，倒位，易位等），能极大提高遗传病的检出率，全方位满足各种疑难遗传病的精准检测。
Q：在使用第三代测序技术之前，团队开展了哪些工作？
A：唐北沙教授研究团队一直致力于FCMTE致病基因的定位与克隆研究工作，旨在阐明其具体遗传学发病机制。该研究工作历经十余年，完成了微卫星Marker及SNP marker定位分析、染色体高分辨核型分析、Array-CGH、全外显子组测序、靶向捕获测序和全基因组测序等技术方法分析，但没有明确发现，提示该神经系统遗传病致病变异的复杂性。
这一系列方法类似于寻找犯罪嫌疑人，定位分析是利用一定的技术手段来判断这个嫌疑人目前处在何处，定在一个大致范围，但还不能完全找到他，得通过一系列方法来甄别；核型分析、CGH等方法是比较老的细胞遗传学方法，只能扫描到特别大的特征信息，比如嫌疑人如果缺胳膊少腿可以看出来，而如果没有这些特征，这些方法就找不到他；全外显子测序、靶向测序和全基因组测序是二代测序技术，能全面扫描嫌疑人的特点，如身高、体重、穿着、外貌等十分具体的信息，但有些嫌疑人隐藏较好，比如躲在地下空间，就发现不了。
Q：团队是如何将三代测序技术应用于此次项目研究中的？
A：三代测序技术相比一、二代要更先进一些，相当于“广撒网钓大鱼”，躲藏在地下的嫌疑人也能把他挖出来。在此之前，日本学者就通过二代测序技术找到了致病基因的线索，然后等到三代测序技术逐渐兴起后用其成功进行验证。
2016年，唐北沙教授研究团队将研究目标转向复杂结构变异，如短串联重复序列异常扩展变异。在这项最新研究中，我们团队联合王凯教授及希望组团队最终运用Oxford Nanopore和PacBio Sequel的长读长测序技术，并结合针对STR expansion检测敏感性高的Repeat HMM、inScan分析软件等准确检测及鉴定出中国人群FCMTE致病基因SAMD12的五核苷酸重复序列高度异常扩展的致病变异。
Q：既然二代测序有太多不如三代测序之处，是否未来会被完全取而代之？
A：这是一个很好的问题。尽管二代测序技术存在读长过短、GC偏好等局限，无法准确检测重复序列区域引起的疾病。而三代测序技术，例如Oxford Nanopore和PacBio的长读长测序技术，凭借超长读长及轻松跨越高GC、高重复区域等优势，可有效检测基因组的重复序列扩张变异。但我们仍然认为其无法完全取代二代。
因为，就像二代测序并没有完全取代一代测序一样，二代测序发展了近十年，虽然有其技术的瓶颈与缺陷，但其本身也在不断改进和创新。而三代测序技术虽然在某些方面弥补了二代测序的缺陷，但其投入市场还只有两三年，技术还具有不稳定性，后期海量数据处理与分析都是难点，且目前单个样本的测序费用仍然较高。所以，它的出现更多的是让人们多了一种解决问题的方法。就目前看来，二代测序技术和三代测序技术各有所长，在很长一段时间会共存于市场，研究者可根据需要自己选择。
Q：相关研究在未来有着怎样的应用前景？
A：在现有的技术手段下，还有超过一半的遗传疾病未获得明确的诊断，这可能是人们对致病突变的认识不够，也可能是技术方法缺陷而漏检。而三代测序技术的出现给人们提供了一个新的选择，部分诊断未明的遗传疾病或可通过尝试三代测序技术获得最终基因诊断，从而进一步认识疾病，预防疾病，降低诊疗成本。除此之外，三代测序技术在转录组测序和表观遗传学研究领域也有很好的应用前景。
图1：探索FCMTE致病基因的研究流程
图2：PacBio Sequel测序数据分析明确TTTTA和TTTCA扩展
图3：Nanopore测序数据分析进一步明确TTTTA和TTTCA扩展
图4：RP—PCR技术验证明确了(TGAAATAAAA)n异常扩展
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